了解一下牛血清白蛋白的提取方法吧
更新時(shí)間：2022-04-20 點(diǎn)擊次數(shù)：4130次
牛血清白蛋白BSA大概是生化實(shí)驗(yàn)室最為常見、應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)了。雖然小小的BSA并不那么起眼，但是在生化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，卻常常扮演十分關(guān)鍵的角色。
BSA前體蛋白全長607個(gè)氨基酸。前體蛋白從N端脫去18個(gè)信號(hào)肽，以及6個(gè)前肽，形成含有583個(gè)氨基酸、分子量約為66.5kDa的成熟BSA蛋白。
牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟：
1.血液分離
取新鮮的牛血液6000毫升，加入667毫升38%的檸檬酸三鈉，使檸檬酸三鈉在牛血液中的終重量濃度為3.8%，然后通過血球分離機(jī)(GFX-105血液分離機(jī)、遼陽翔隆制藥機(jī)械有限公司)，對(duì)牛血液進(jìn)行分離(轉(zhuǎn)速16300rpm/min)，分離得到血細(xì)胞和血漿。
2.蛋白沉淀溶解
2.1取步驟1中的血漿4000毫升，加入6000毫升的飽和硫酸銨，使硫酸銨在血漿中的終濃度為60%，并攪拌1h，使血漿中的蛋白質(zhì)沉淀，去除上清液，保留蛋白沉淀。
2.2按與蛋白沉淀的質(zhì)量比為5:1的比例加入超純水6000毫升，溶解上述蛋白沉淀，得到蛋白溶解液7000毫升。
3.第一次濃縮換液
通過超濾機(jī)對(duì)步驟2.2中得到蛋白溶解液進(jìn)行超濾濃縮，超濾機(jī)上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾機(jī)的參數(shù)(MiniPellicon超濾系統(tǒng)、merkmillipore公司)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，濃縮10倍，同時(shí)，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行換液。即用恒流泵將第一磷酸鹽緩沖液加入到正在濃縮過程中的蛋白溶解液中，并通過恒流泵控制第一磷酸鹽緩沖液的流速使蛋白溶解液的體積維持穩(wěn)定，得到蛋白濃縮液700毫升。
4.第一次純化
用層析純化儀(APPSMV100D、利穗(蘇州)科技有限公司)對(duì)上述蛋白濃縮液進(jìn)行層析純化，以二乙基氨基乙基-纖維素(二乙基氨基乙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液平衡，流速10ml/min，平衡體積5CV;平衡結(jié)束后，將蛋白濃縮液上柱層析，控制流速8ml/min;上樣結(jié)束后，用平衡液平衡5CV，流速為10ml/min;用含1mol/L氯化鈉的20mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫(從0%B到100%B拉梯度洗脫，共10CV)，收集得到粗白蛋白溶液400ml毫升。洗脫后，用2mol/L的氯化鈉溶液對(duì)層析柱進(jìn)行再生處理。
5.第二次進(jìn)行換液
通過超濾機(jī)對(duì)步驟4中得到粗白蛋白溶液進(jìn)行超濾濃縮，超濾機(jī)上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾系統(tǒng)的參數(shù)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行換液。得到粗蛋白液600毫升。
6.第二次純化
用層析純化儀對(duì)上述粗蛋白濃縮液層析純化，以磺丙基-纖維素(磺丙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液平衡，流速6ml/min，平衡體積10CV;平衡結(jié)束后，將蛋白濃縮液上柱層析，流速4ml/min，直接收集流出液，得到高純度的低雜質(zhì)含量的牛血清白蛋白溶液1000ml毫升。經(jīng)冷凍干燥后記得到牛血清白蛋白粉。
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