TaqMan探針法
TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的5'-3’外切核酸酶活性，切斷探針,產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合,所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和-條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合,其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5端標記有報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等 ，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q) ,如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收,儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行, Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針,其3'→5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團,其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(如下圖)。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段樣,有個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
SYBR Green I染料法
SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是-種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料(如下圖) 。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量k。 SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是:
1、開始反應(yīng)，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。
2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。
3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。
4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
如何做選擇：
SYBR Green熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合,對DNA模板沒有選擇性,所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果,對PCR引物設(shè)計的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下,本法是-種成本低廉的選擇。
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