A 產(chǎn)品組成—PicoPLEX WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒
組份 | 蓋子顏色 |
Cell Extraction Buffer 細胞提取緩沖液 | 綠色 |
Extraction Enzyme Dilution Buffer 提取酶稀釋緩沖液 | 紫色 |
Cell Extraction Enzyme 細胞提取酶 | 黃色 |
Pre-Amp Buffer 預(yù)擴增緩沖液 | 紅色 |
Pre-Amp Enzyme 預(yù)擴增酶 | 白色 |
Amplification Buffer 擴增緩沖液 | 桔色 |
Amplification Enzyme 擴增酶 | 藍色 |
Nuclease-Free water 無核酸酶水 | 無色 |
User Manual 使用手冊 |
試劑量可供50次反應(yīng)。
B PicoPLEX WGA Kit儲存與處理
-20℃儲存。
使用前，細胞提取酶、預(yù)擴增酶和擴增酶組份放到冰上。其他組份使用前在冰上解凍并且稍微漩渦振蕩（vortex and quick-spin）。
試劑儲存、處理和反應(yīng)設(shè)置都要遵守實驗室PCR操作規(guī)范。
C單細胞全基因組擴增試劑盒其他準備材料
熱循環(huán)儀（PCR儀，推薦使用實時PCR儀）
PCR管或96孔PCR板
低吸附吸頭（Low-binding barrier tips）
磷酸鹽緩沖液（PBS）
D PicoPLEX WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒產(chǎn)品描述
單管，3步，PicoPlEX WGA試劑盒專門用于人單細胞和pg級DNA的擴增，具有可重復(fù)性、低背景的特點。3小時內(nèi)完成細胞裂解、熱循環(huán)文庫制備和低背景擴增，zui終能得到2-5µg擴增DNA。
PicoPLEX單細胞全基因組擴增流程
細胞+裂解/提取緩沖液，15min ——預(yù)擴增混合液，90min ——擴增混合液，30min ——分析
PicoPLEX WGA Kit適用樣本
1.1-10個人細胞，如：囊胚細胞、極體、滋胚層細胞、羊水細胞、循環(huán)腫瘤細胞、培養(yǎng)細胞等。
2.1000-10000個細菌細胞
3.分離DNA（15pg-50pg人DNA）
4.分選染色體（Sorted Chromosomes ）
5.不完整或片段化，單/雙鏈DNA
6.樣本zui大體積：5µL
E PicoPLEX WGA全基因組擴增產(chǎn)物應(yīng)用
拷貝數(shù)變異（CNV）分析，基于oligonucleotide aCGH, BAC aCGH, or qPCR
SNP 基因表型
突變檢測
F PicoPLEX單細胞全基因組擴增細胞樣本采集
細胞采集方法
兼容PicoPLEX WGA Kit的正確細胞采集方法有流式分選術(shù)，稀釋和顯微操作。細胞染色后可能會對試劑盒性能造成不好影響。為了得到*結(jié)果，一定要避免使用福爾馬林固定法。
細胞洗滌
細胞樣本制備時強烈推薦用PBS洗滌，以盡量減少非細胞DNA污染。選擇不含鎂、鈣、BSA的PBS。zui終細胞樣本中所含PBS體積不能超過2.5µL。
G 使用擴增后的對照DNA作為參照
DNA對照樣本對于某些如微陣列和qPCR平臺有參照價值。為了得到更準確的結(jié)果，強烈推薦PicoPLEX擴增樣本的對照選擇PicoPLEX擴增后的DNA對照而不是沒有擴增的DNA對照。
DNA對照樣本按樣本配制方法（J）配制，按PicoPLEX操作步驟（K）擴增。Pooling DNA對照的擴增反應(yīng)的產(chǎn)物可以得到*結(jié)果。
H PicoPLEX WGA全基因組擴增產(chǎn)物純化和定量
WGA單細胞全基因組擴增產(chǎn)物用于下游時，許多應(yīng)用使用前需要純化和定量。純化方法可以使用 spin columns或過濾板。
產(chǎn)物定量使用紫外吸光度法（UV absorbance ，1 OD260 = 50 µg/mL）。PicoGreen™或其他雙鏈DNA定量法所得PicoPLEX產(chǎn)物密度可能不可靠。
純化后的PicoPLEX擴增產(chǎn)物-20 °C儲存。
I 選擇合適的反應(yīng)管/反應(yīng)板
PicoPLEX操作指南的步驟7中，如果孵育時PCR管/板密封性不夠，會造成大量（>5 µL）的試劑蒸發(fā)，zui終影響PicoPLEX WGA結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
步驟7也可以加15 µL 水，無視所選反應(yīng)管/板密封性能否盡量減少蒸發(fā)造成的體積損失。（A mock PicoPLEX Protocol Step 6 incubation using 15 µL of water is advised to confirm whether a selected tube or plate/seal combination can be used with minimal volume loss due to evaporation.）
J樣本配制方法
5µL細胞樣本
1.依照F所述方法用PBS稀釋或淋洗細胞。
2.如果采用流式分選采集細胞：
單個細胞加入含5 µL細胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔。
如果采用顯微操作或稀釋法：
單個細胞先用zui少PBS（<2.5 µL)）混合，再加入含適量細胞提取緩沖液（綠蓋）的PCR管/孔，zui終樣本體積5 µL。
- 配制好的細胞立即 -80 °C 凍存或直接進行擴增操作。
5µL DNA樣品（單細胞simulation）
1.配制1 ng/µL 純化DNA溶液：PCR管/孔中，5 mM Tris-HCl (pH8.0)稀釋對照DNA。
2.漩渦振蕩30s。
3.配制15 pg/µL DNA溶液：3µL 1 ng/µL DNA溶液+197 µL 5 mM Tris-HCl (pH 8.0)。
4.漩渦振蕩30s。
5.PCR管/孔中，1 µL 15 pg/µL DNA溶液+ 4 µL 細胞提取緩沖液（綠蓋）。
K PicoPLEX操作步驟
細胞提取
1.添加提取混合液各組份并充分混勻。
Extraction Cocktail Component 提取混合液組份 | 蓋子顏色 |
Extraction Enzyme Dilution Buffer 提取酶稀釋緩沖液 | 紫色 |
Cell Extraction Enzyme細胞提取酶 | 黃色 |
2.每5µL細胞樣本或DNA樣本（J部分配制）加5 µL新鮮配制的提取混合液。
3.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：
1 cycle | 75 °C | 10 min |
1 cycle | 95 °C | 4 min |
1 cycle | 室溫 | Hold |
4.試管/板稍微離心。
預(yù)擴增
5.添加預(yù)擴增混合液各組份并充分混勻。
Pre-Amp Cocktail Component 預(yù)擴增混合液各組份 | 蓋子顏色 |
Pre-Amp Buffer 預(yù)擴增緩沖液 | 紅色 |
Pre-Amp Enzyme 預(yù)擴增酶 | 白色 |
6.每個細胞樣本/DNA樣本加5µL預(yù)擴增混合液。
7.按下表在熱循環(huán)儀中孵育樣本：
1 cycle | 95°C | 2 min |
12 cycles | 95°C | 15 s |
15°C | 50 s | |
25°C | 40 s | |
35°C | 30 s | |
65°C | 40 s | |
75°C | 40 s | |
1 cycle | 4°C | Hold |
8.稍微離心，預(yù)擴增孵育產(chǎn)物放到冰上。
擴增
9.添加擴增混合液各組份并充分混勻。
Amplification Cocktail Component 擴增混合液組份 | 蓋子顏色 |
Amplification Buffer 擴增緩沖液 | 桔色 |
Amplification Enzyme 擴增酶 | 藍色 |
Nuclease-Free Water 無核酸酶水 | 透明 |
注意：樣本擴增效率可以通過在擴增混合液中添加SYBR Green I dye（zui終密度：0.125x）進行實時PCR儀分析。一些儀器需要額外添加其他染色劑做信號歸一化（signal normalization）。
10. 新鮮配制的擴增混合液取60 µL和15 µL預(yù)擴增孵育產(chǎn)物混合，吸管混勻。
11.按下表在熱循環(huán)儀中擴增樣本：
1 cycle | 95 °C | 2 min |
14 cycles | 95°C | 15 s |
65°C | 1 min | |
75°C | 1 min | |
1 cycle | 4°C | hold |
注意：基于Rubicon用流式分選培養(yǎng)細胞的測試，推薦14 cycles。一些細胞類型要獲得zui高產(chǎn)量，可能需要更多cycles（zui高達16 cycles）。
12.PicoPLEX 擴增產(chǎn)物立即 -20 °C儲存或用于下游純化（見H）。
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RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒
從單細胞中擴增DNA構(gòu)建高重復(fù)性的文庫現(xiàn)在成為可能。PicoPLEX WGA kit采用技術(shù)，設(shè)計、優(yōu)化用于從單細胞中擴增單拷貝基因組DNA。起始量低至單細胞或6pg基因組DNA。便捷的單管操作流程減少失誤，節(jié)省時間并降低反應(yīng)背景。
PicoPLEX WGA Kit兼容微陣列比較基因組雜交（array CGH）分析及PCR平臺，被試管嬰兒行業(yè)供應(yīng)商如BlueGnome信賴并用于PGS/PGD。
產(chǎn)品訂購信息
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
RB3050/R30050 | PicoPLEX WGA Kit單細胞全基因組擴增試劑盒，array CGH、PCR分析用 | 50次反應(yīng) |
RB3381/R300381 | PicoPLEX DNA-seq Kit，48種雙端illumina引物 | 48 |
選購RB3050 Rubicon PicoPLEX WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒產(chǎn)品歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 ：152 1681 4001。華雅再生醫(yī)學(xué)-客服: 316 808 6348。
紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司以“傳遞科學(xué)價值，服務(wù)科學(xué)研究”為宗旨，主營：干細胞、醫(yī)療、細胞治療、器官再生 四大板塊的產(chǎn)品。
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